Наиболее прославленное произведение Леонардо — знаменитая «Тайная вечеря» в миланском монастыре Санта Мария делла Грацие. Эта роспись, в настоящем своём виде представляющая руину, была выполнена между 1495—1497 годами. Причина быстрой порчи, давшей о себе знать уже в 1517 году, заключалась в своеобразной технике, сочетавшей масло с темперой.
В связи с «Тайной вечерей», Джорджо Вазари (автор жизнеописаний итальянских художников, 1511—1574) приводит в описании жизни Леонардо забавный эпизод, прекрасно характеризующий манеру работы художника и его острый язык. Недовольный медлительностью Леонардо, приор монастыря настойчиво требовал от него, чтобы он скорее закончил своё произведение. «Ему казалось странным видеть, что Леонардо целую половину дня стоит погружённый в размышление. Он хотел, чтобы художник не выпускал кисти из рук, наподобие того, как не прекращают работу на огороде. Не ограничиваясь этим, он пожаловался герцогу и так стал донимать его, что тот был вынужден послать за Леонардо и в деликатной форме просить его взяться за работу, всячески давая при этом понять, что всё это он делает по настоянию приора». Затеяв с герцогом разговор на общие художественные темы, Леонардо затем указал ему, что он близок к окончанию росписи и что ему остается написать лишь две головы — Христа и предателя Иуды. «Эту последнюю голову он хотел бы ещё поискать, но в конце концов, если он не найдет ничего лучшего, он готов использовать голову этого самого приора, столь навязчивого и нескромного. Это замечание весьма рассмешило герцога, сказавшего ему, что он тысячу раз прав. Таким-то образом бедный смущённый приор продолжал подгонять работу на огороде и оставил в покое Леонардо, который закончил голову Иуды, оказавшуюся истинным воплощением предательства и бесчеловечности».
К миланской росписи Леонардо готовился тщательно и долго. Он выполнил множество набросков, в которых изучал позы и жесты отдельных фигур. «Тайная вечеря» привлекла его не своим догматическим содержанием, а возможностью развернуть перед зрителем большую человеческую драму, показать различные характеры, вскрыть душевный мир человека и точно и ясно обрисовать его переживания. Он воспринял «Тайную вечерю» как сцену предательства и поставил себе целью внести в это традиционное изображение то драматическое начало, благодаря которому оно приобрело бы совсем новое эмоциональное звучание.